Трифлон

Скачать

Трифлон: - в начале была идея…

Кузьмин А.А., кандидат ветеринарных наук

Боровко А.Н.

Сахацкий И.Н., кандидат ветеринарных наук

Соколов Ю.В., кандидат фармацевтических наук

АО «Биофарм», г. Харьков

Контроль заболеваемости птицы, вызванной патогенными штаммами E. сoli, а также другими микроорганизмами, является очень актуальным  в промышленном птицеводстве. Препараты, предназначенные для этих целей, должны иметь следующие свойства:

  1. Высокая противомикробная активность
  2. Медленное развитие резистентности у микроорганизмов
  3. Высокая технологичность применения (легкость введения с питьевой водой, высокая растворимость в воде, возможность комбинирования с другими медикаментозными и иммунобиологическими препаратами)
  4. Отсутствие токсичности
  5. Отсутствие отрицательного действия на продуктивность птицы
  6. Отсутствие отрицательного  влияния на качество мяса
  7. Отсутствие отрицательного действия на сапрофитную и полезную микрофлору
  8. Короткий период выведения из организма птицы с целью недопущения попадания остаточных количеств препарата в пищу человеку.

Вследствие регулярного использования антибиотиков и других антимикробных препаратов в промышленном птицеводстве микроорганизмы выработали к ним разную степень устойчивости, из-за чего эффективность традиционных противомикробных средств в большинстве случаев не удовлетворяет практических ветеринарных врачей.

Перед научным подразделением АО «Биофарм» была поставлена задача разработать противомикробный препарат, который отвечает всем вышеперечисленным качествам. В результате теоретической проработки было установлено, что наивысшей антимикробной активностью против кишечных патогенов у птиц обладает энрофлоксацин, а также ко-тримоксазол (комбинация триметоприма с сульфаниламидом) [1]:

 

Рис. 1. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для E. сoli противомикробных препаратов (мкг/мл, 1204 изолятов)

 

Ко-тримоксазол и энрофлоксацин давно с успехом применяются как противомикробные средства в гуманной и ветеринарной медицине. Оба препарата имеют широкий спектр действия, подобные фармакокинетические особенности, низкую токсичность и медленное образование резистентности к ним у микроорганизмов.

Ко-тримоксазол давно известен,  как химиотерапевтическое  средство с широким спектром бактериостатического действия, обусловленного блокированием биосинтеза фолатов в микробных клетках: сульфаниламид блокирует синтез дигидрофолиевой кислоты, а триметоприм препятствует преобразованию дигидрофолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую. В последние годы пришло новое понимание роли триметоприма и сульфаниламидов в этом комбинированном препарате [2]. Установлено, что эффективность комбинации триметоприма с сульфаниламидом, которая выявлена in vitro, не является такой же in vivo, т.е. в организме человека или животных.  В опытах in vitro наиболее эффективным было сочетание 1 части триметоприма и 20 частей сульфаниламида [3]. При этом для достижения такого же соотношения концентраций в плазме крови, количество триметоприма и сульфаниламида в препаратах, предназначенных для введения внутрь, должно было быть равным 1:5.  Это соотношение было выбрано в качестве своеобразного стандарта. Однако бактериемия встречается редко. В большинстве клинических случаев имеет значение концентрация противомикробных средств не в крови, а в органах и тканях, в месте локализации микроорганизмов. В связи с высокой липофильностью, концентрация триметоприма в органах и тканях, а также моче,  значительно превосходит концентрацию в плазме крови.  Для сульфаниламидов такая разница отсутствует. Вследствие высокой липофильности, кажущийся объем распределения триметоприма (около 100 л для человека) более чем в 12 раз превосходит объем распределения сульфаметоксазола (около 8 л), поэтому соотношение концентраций препаратов в тканях значительно отличается от 1:20. В моче, например, оно может достигать 1:1; при этом какой-либо синергизм отсутствует. Таким образом, сульфаниламидный компонент в местах нахождения микроорганизмов не может достичь концентрации, достаточной для выраженного противомикробного действия и представляет собой балласт. Кроме того, сульфаниламиды вносят значительный вклад в развитие побочных реакций, которые возникают после применения комбинированных препаратов [3].

В результате было принято решение исключить из разрабатываемого препарата сульфаниламидный компонент, как неэффективный и токсичный.

Энрофлоксацин продолжает оставаться одним из основных противомикробных средств в ветеринарной медицине. Несмотря на продолжительное применение, резистентность к нему  у микроорганизмов вырабатывается достаточно медленно. Он имеет низкую токсичность и широкий спектр действия. Практически не вызывает кишечного дисбактериоза. Имеет относительно низкую цену.

Комбинация энрофлоксацина и триметоприма была признана нами очень перспективной для создания нового  препарата, предназначенного для применения в птицеводстве. Основные трудности заключались в том, что из энрофлоксацина можно легко изготовить пероральный раствор, а триметоприм существует только в виде порошка и суспензии для перорального применения. В результате исследований, направленных на получение растворимой в воде формы триметоприма, нами впервые в мировой практике был получен раствор триметоприма, пригодный для перорального применения в виде водного раствора, совместимого с раствором энрофлоксацина.  Комбинированный раствор триметоприма (5%) и энрофлоксацина (10%) носит название «Трифлон». Трифлон сохраняет стабильность в воде любой жесткости, любой концентрации и полностью пригоден для применения через системы поения в промышленном птицеводстве.

Фармацевтическая  совместимость

Изучение фармацевтической совместимости триметоприма и энрофлоксацина проводилось путем изучения основных физико-химических свойств растворов этих синтетических противомикробных средств. Для этого были изготовлены  растворы триметоприма и энрофлоксацина разных концентраций в разных растворителях при разных условиях температуры и рН.  Были определены оптимальные условия, при которых энрофлоксацин и триметоприм содержатся в дисперсной системе в виде истинных  растворов, что достигнуто впервые.

Стабильность

Стабильность препарата определяли с помощью метода ускоренного старения в трех сериях препарата.

Препарат “Трифлон” помещали в термостат при температуре 40±20С и относительной влажности 75±5%, выдерживали определенное время и анализировали с целью количественного определения триметоприма и энрофлоксацина. При каждом анализе определялась концентрация триметоприма и энрофлоксацина в 3 сериях препарата. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Концентрация триметоприма и энрофлоксацина в препарате “Трифлон”, подвергнутому  ускоренному старению

Время с начала опыта, месяцев

Истинное время, соответствующее исследовательскому, месяцев

Концентрация энрофлоксацина, % (n=3)

Концентрация, триметоприма, % (n=3)

1

4

10,0±0,2

5,0±0,1

2

8

9,9±0,12

4,97±0,08

3

12

9,8±0,31

4,93±0,12

4,5

18

9,7±0,24

4,9±0,11

6

24

9,66±0,27

4,8±0,13

9

36

9,62±0,1

4,76±0,2

10,5

42

9,23±0,067

4,72±0,02

В результате проведенных исследований установлено, что на протяжении 36 месяцев эксперимента концентрация триметоприма и энрофлоксацина в готовой лекарственной  форме препарата “Трифлон” была в пределах нормы и отвечала требованиям нормативно-технической документации.

Таким образом, препарат годен для использования на протяжении 3 лет с момента изготовления.

Токсичность

Исследование токсичности препарата «Трифлон» проводили на птице в условиях ООО «Балагропромсервис», Балаклеевского района, Харьковской области. В опытах использовали цыплят возрастом 90 суток и живым весом 950-1000 г. Из отобранных цыплят было сформировано 5 групп (по 20 голов) - 4 подопытные и 1 контрольная. С целью определения токсичности препарата «Трифлон», цыплятам подопытных групп задавали препарат с питьевой водой в следующих дозах:

- группа 1 – 1 мл препарата на 1 л питьевой воды (терапевтическая доза);

- группа 2 – 3 мл препарата на 1 л питьевой воды (трехкратная терапевтическая доза, 3Х);

- группа 3 – 5 мл препарата на 1 л питьевой воды (пятикратная терапевтическая доза, 5Х)

- группа 4 – 10 мл препарата на 1 л питьевой воды (десятикратная терапевтическая доза. 10Х);

 

Контрольной группе выпаивали чистую питьевую воду. Всех животных содержали в одинаковых условиях с одинаковым рационом.

На протяжении всего периода исследований (10 суток) за поголовьем цыплят вели наблюдение. При этом учитывали: общее состояние птицы, состояние кожи и слизистых оболочек, состояние аппетита (поедаемость кормов), количество выпитой воды, температуру тела, пульс, количество дыхательных движений.

По результатам наблюдений за цыплятами подопытных групп 1X, 3X и 5X на протяжении 10 суток не установлено никаких изменений в общем состоянии, аппетите, потреблении воды. Температура тела, пульс, дыхание находились в пределах физиологической нормы.

В дозе 10X были отмечены случаи диареи. Эти эффекты исчезли после окончания опыта.

Фармакодинамика

Энрофлоксацин - противомикробное средство широкого спектра действия из группы фторхинолонов. Механизм действия связан с угнетением бактериальной ДНК-гиразы, что приводит к нарушению репликации ДНК бактерий.

Триметоприм - противомикробное средство широкого спектра действия из группы диаминопиримидинов.  Механизм действия связан с угнетением бактериальной редуктазы дигидрофолиевой кислоты. Бактериальная дигидрофолатредуктаза  в 50-100 тысяч раз чувствительнее к триметоприму, чем у животных и человека. Триметоприм блокирует один из этапов синтеза нуклеиновых кислот - образование тетрагидрофолиевой кислоты из дигидрофолиевой, которая является субстратом для синтеза нуклеиновых кислот бактерий.

Таким образом, оба препарата у микробов действуют на разные звенья одного и того же процесса - синтеза нуклеиновых кислот, что является предпосылкой для проявления потенцированного синергизма.

Фармакокинетика

Энрофлоксацин  хорошо и быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта и распределяется в органах и тканях. Терапевтические концентрации достигаются через 1-1,5 часа после введения и сохраняются 24 часа. Присутствие корма в желудке не влияет на степень адсорбции препарата. Связывание энрофлоксацина с белками составляет 24±2%. Наивысшие концентрации энрофлоксацина достигаются в желчи, почках, печени, легких, репродуктивных органах. Экскреция энрофлоксацина происходит преимущественно почками. Период полувыведения составляет 3 - 5 часов.  Метаболиты выводятся с мочой и калом.

Триметоприм быстро всасывается из кишечного тракта, хорошо распределяется по всем тканям и жидкостям. Концентрации триметоприма в тканях выше, чем в крови. Высокие уровни триметоприма наблюдаются в легких, почках и печени. Концентрация триметоприма в сыворотке крови достигает максимума через 1,5 часа после введения. Метаболизируется в печени и выделяется, главным образом, почками путем клубочковой фильтрации и активной канальцевой секреции. Концентрация в моче значительно выше, чем в крови. Период полувыведения составляет 8 - 10 часов.

Сходство фармакокинетических параметров энрофлоксацина и триметоприма (биодоступность, период полувыведения) позволяет комбинировать их в одном препарате.

Противомикробная активность и спектр действия

Энрофлоксацин  обладает противомикробным действием на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы (E. сoli, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium spp., Listeria monocytogenes, Corinebacterium spp., Pseudomonas, Haemophilus spp., Salmonella spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Pasteurella spp. и прочие), а также действует на микоплазмы и хламидии.

Триметоприм имеет противомикробное действие относительно грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (E. coli, Klebsiella spp., Salmonella spp., Pasteurella spp., Enterobacter spp.,  Proteus spp., Shigella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Haemophilus spp., Chlamidia), а также  действует на токсоплазмы и кокцидии.

Противомикробную активность трифлона in vitro изучали двумя методами.

 В первом опыте методом микроразведений сравнивали трифлон с двумя импортными препаратами, содержащими энрофлоксацин в концентрации 10%. Результаты опыта представлены в таблице 2 (минимальная ингибирующая концентрация, МИК, мкг/мл) и в таблице 3 (минимальная бактерицидная концентрация, МБК, мкг/мл). В опыте использовали Staphylococcus aureus P 209 и полевой штамм E. сoli. Расчет МИК и МБК велся по энрофлоксацину [5].

Таблица 2. Минимальная ингибирующая концентрация  трифлона и препаратов сравнения, мкг/мл (n=5)

Препарат

E. сoli

Staphylococcus aureus P 209

Трифлон

0,07

0,07

Препарат №1 (10% энрофлоксацин)

0,09

0,09

Препарат №2 (10% энрофлоксацин)

0,09

0,09

 Таблица 3. Минимальная бактерицидная концентрация  трифлона и препаратов сравнения, мкг/мл

Препарат

E. сoli

Staphylococcus aureus P 209

Трифлон

0,58

0,29

Препарат №1 (10% энрофлоксацин)

0,78

0,39

Препарат №2 (10% энрофлоксацин)

0,78

0,39

 Во втором опыте с помощью диско-диффузного метода изучали противомикробную активность трифлона в сравнении с другими антибиотиками (таблица 5). В качестве тест-культур использовали штамм E. coli О78 и Salmonella typhimurium.

Таблица 4. Чувствительность бактериальных культур к трифлону и различным антибиотикам (диско-диффузный метод)

Культуры

Антибиотик

Содержание в диске, мкг

Зона задержки роста, мм

E. coli

Трифлон

5/5

30

Энрофлоксацин

5

26

Фторфеникол

30

25

Спектиномицин

100

25

Колистин

10

15

Линкомицин

2

0

Salmonella typhimurium

Трифлон

5/5

32

Энрофлоксацин

5

27

Фторфеникол

30

24

Спектиномицин

100

21

Колистин

10

15

Линкомицин

2

0

 Из приведенных данных видно, что трифлон имеет выраженное преимущество в антимикробной активности по сравнению с другими антибиотиками.

Опыт практического применения

С целью изучения профилактической эффективности трифлона при выращивании бройлеров, в одном из крупных хозяйств был поставлен опыт на 560500 головах цыплят. Трифлон задавался с питьевой водой в дозе 1 л на 1000 л питьевой воды с 1 по 5 день жизни. Забой цыплят в подопытной и контрольной группах осуществлялся на 43 день. Препаратом сравнения был импортный препарат, содержащий 10% энрофлоксацина. Результаты опыта представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты применения трифлона и препарата сравнения с профилактической целью на цыплятах бройлерах

Препарат

Количес

тво голов

Средний вес при убое, г

Сохран

ность, %

Конвер

сия корма

Средне

суточный привес, г

�?ндекс продук

тивности

Трифлон

272500

2330

95,74

1,9

53,64

270,40

10% энрофлоксацин

288000

2291

93,29

1,9

53,5

262,82

 Выводы

  1. Создан новый, высокоэффективный комбинированный противомикробный препарат – Трифлон, содержащий 10% энрофлоксацина и 5% триметоприма.
  2. Трифлон является стабильным препаратом, легко растворяющимся в воде любой жесткости, пригодным для введения в систему поения с помощью медикаторов.
  3. Противомикробная активность трифлона на всех испытанных культурах микроорганизмов была выше традиционно применяемых препаратов.
  4. Комбинация энрофлоксацина и триметоприма в препарате Трифлон обладает синергизмом.
  5.  В терапевтических и увеличенных в 5 раз дозах трифлон не оказал отрицательного влияния на подопытных цыплят.
  6. Производственные испытания Трифлона показали его преимущество над  препаратами, содержащими только энрофлоксацин.

Список литературы

 

  1. http://www.octagon-services.co.uk/articles/poultry_pathogens.htm
  2. Страчунский Л.С., Козлов Р.С. Современные взгляды на применение ко-тримоксазола. - Клиническая фармакология и терапия. - 1997; т.6, №2, стр.27-31.
  3. Bushby S.R.M., Hitchings G.H. Trimetoprim, a sulphonamide potentiator. - Br. J. Pharmacol., 1968, 33, 72-90.
  4. Brumfitt W., Hamilton-Miller J.M.T. - Limitations of and indications for the use of co-trimoxazole. J. Chemother., 1994, 6, 3-11.
  5. Экспертное заключение Института ветеринарной медицины УААН, №211 от 26.06.2009.

Все статьи »
Свежие статьи